止咳硬膏治疗lewis肺癌小鼠咳嗽的实验研究

　　作者：孙宏新1 蒋士卿2 牛喜伟1 马纯政1 刘培民1

　　工作单位：河南省中医院

　　【摘   要】 目的 观察止咳硬膏外敷治疗lewis肺癌小鼠咳嗽的疗效。方法 将氨水实验阳性C57小鼠30只随机分为止咳硬膏实验组、康琦平喘止咳贴对照组及空白布贴组。在每只小鼠左侧腋窝皮下接种0.2mllewis肺癌肿瘤匀浆液。接种成功后第2天开始每天外用贴膏给药1次,4h/只,连续给药。每3天测小鼠体重。第8天氨水引咳法测得咳嗽潜伏期的秒数及2min咳嗽次数;第15天酚红排泄实验法测得OD值;眼球摘除取血后采用酶联免疫吸附法(Elisa法)测得血清中IL-6的含量;颈椎脱臼处死动物，称量小鼠体重、剥离出移植瘤，称重并计算抑瘤率后结束实验。【结 果】止咳硬膏可以延长小鼠肺癌咳嗽潜伏期，减少2min内咳嗽次数、提高小鼠气管段酚红排泄量，有明显止咳化痰作用，降低血清中IL-6表达。【结 论】 止咳硬膏对肺癌咳嗽有一定的止咳作用。

　　【关键词】止咳硬膏;肺癌咳嗽

　　肺癌是最常见的恶性肿瘤之一，在临床上其发病率和死亡率均位居癌症首位[1]。肺癌咳嗽是其常见症状,临床治疗颇为棘手，严重影响患者生活质量。西医用药胃肠损伤较大，不利于后续治疗。而中医特色中穴位贴敷法，穴位刺激及药物的双重作用，不经过消化系统药物吸收避免了药物的胃肠副作用，且可以持续给药，无创伤、痛苦小，易于患者接受。穴位选大椎及肺俞，主祛风散寒、宣肺止咳，脾俞健脾化痰的作用[2]。

　　IL-6由肺癌细胞产生，是肺癌的一种自分泌生长因子，对肺癌的诊断及有无远道转移及预后评估，血清中IL-6含量均有重要临床意义[3]。目前研究表明，IL-6系前炎症反应因子[4]具有多种生物功能，其可通过激活转录因子，促进肿瘤细胞的增殖、抗凋亡、肿瘤新生血管形成、迁移等，最终促进肿瘤的进一步发展。肺癌咳嗽大多与肿块压迫刺激、炎症感染有关，而这些皆与IL-6有关，因此IL-6间接反应了肺癌咳嗽的情况，肺癌咳嗽与IL-6血清含量呈正相关性。

　　1 材料与方法

　　1.1 肺癌小鼠造模

　　选用体重为18-22g的雄性清洁级级C57小鼠40只(购于北京维通利华实验技术有限公司)，适应性喂养1周后，氨水实验选择咳嗽阳性小鼠。从荷瘤小鼠(中国医学科学院提供)上选取生长良好的lewis肺癌肿块，剥离，研磨。配比成移植肿瘤：生理盐水(1:3)的肿瘤匀浆液，细胞计数大于3×1010/L。于超净工作台内将每只小鼠均左侧腋窝皮下接种肿瘤匀浆液0.2ml，3d后接种部位出现3mm皮下结节者，移植瘤模型建立成功。

　　1.2 分组与治疗

　　任意选出30只出现皮下结节小鼠随机分为3组，止咳硬膏实验组、康琦平喘止咳贴对照组及空白布贴组，每组10只。小鼠为黑色采用尾部标记法分组并称重。第4天开始背部贴敷给药1次,4h/只。将3组小鼠颈背部绒毛剪去，涂上配制好的8%硫酸钠脱毛剂，面积约3cm*2cm大小，待3-5min毛脱净后，再用棉球沾生理盐水擦拭脱毛部位，以减少脱毛剂对小鼠皮肤的刺激。将1cm*1cm贴布在酒精灯下轻烤后加强粘附力，在实验室助手协助下，用镊子快速固定于小鼠颈背部，对应部位相当于人体大椎穴及肺俞穴处，由于小鼠较小，1cm*1cm贴布可覆盖两穴。小鼠穴位定位参考李忠仁《实验针灸学》(2003 北京：中国中医药出版社)开始每天止咳硬膏、康琦平喘止咳贴及空白贴布贴敷，连续给药。

　　1.3 实验方法及指标的测定

　　1.3.1 氨水引咳实验

　　贴敷第8天氨水引咳法[5]测得咳嗽潜伏期的秒数及2min咳嗽次数。3组小鼠，每天贴敷给药1次4h，连续7d，末次贴敷后，分别将小鼠置于1L的玻璃容器内，其中放一棉球，用1ml注射器每次吸取配比好25%-28%的氨水0.2ml注入棉球，观察并记录小鼠咳嗽潜伏期(从注入氨水开始至产生咳嗽所需要的时间为咳嗽潜伏期)和2min内咳嗽次数(小鼠腹部收缩或缩胸，同时张大嘴记为咳嗽一次)。

　　1.3.2 气管段酚红实验

　　同批小鼠氨水实验后继续每天贴敷给药1次，连续14d，贴敷第21天，酚红排泄实验法[5]测得OD值。末次贴敷后30min后腹腔注射酚红0.01 mL.g-1,注入酚红后0.5 h,脱椎脱离处死动物,剥离气管周围组织,剪下自甲状软骨下至气管分支处的一段气管,放入盛有2 mL生理盐水的试管中,再加0.1mol/L氢氧化钠0.1 mL,静置1小时，待充分反应。用722型分光光度计,波长546 nm测吸光度OD值,与空白贴布组比较。

　　1.3.3 Elisa实验

　　同批小鼠氨水实验后继续每天贴敷给药1次，连续14d，贴敷第21天，进行Elisa实验。摘除眼球采血法，另一实验人员持离心管取血1.5—2.0ml，将5ml离心管室温条件下静置1小时，离心机3000r/min离心15分钟，用移液枪取上层血清0.5—1.0ml，采用酶联免疫吸附法[6]测得血清中IL-6的含量。

　　1.3.4 抑瘤率 称量小鼠体重，颈椎脱臼处死动物后，剥离出小鼠腋窝下移植瘤，称重并结束实验。并按下列公式计算抑瘤率：抑瘤率=(空白组瘤重﹣实验组瘤重)/空白组瘤重×100%。

　　1.4 统计学分析

　　采用SPSS18.0统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，计量资料分别行t检验和单因素方差分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 氨水引咳实验结果 见表1

　　3 讨论

　　肺癌属于中医学的“肺积”、“咳嗽”等范畴，肺积的形成为正气虚损邪毒袭肺，而致肺气膹郁，津液失于输布，津聚为痰，痰凝气滞，痰毒瘀结肺脏，日久成积。医家将无痰而有声音者称为咳，无声而有痰者称为嗽，既有痰又有声音者称为咳嗽。气机不畅、宣将失常、上逆为咳;加之津液输布不利，壅而为痰而之咳嗽。究之临床，很难将两种截然分开，故一般统称为咳嗽[7]。肺癌、咳嗽皆因气机不畅，痰瘀互结所致。肺癌的咳嗽是肺癌内因作用下的外在表现。所以，肺癌咳嗽的是中医“咳嗽”的一部分。中医对肺癌引致的咳嗽记载不多，也多无专章论述，故治疗多在内科咳嗽上加以辨证结合辨病施治。穴位贴敷疗法是中医外治法之一，药物经皮给药治疗疾病。贴敷于某组或某个穴位或特定部位或病变部位上，然后利用药物对机体的穴位或部位的刺激作用和渗透作用，及药物本身中具有调节作用的药理作用渗透达到治疗疾病的目的。药物贴敷于皮肤，将药物缓慢释放,同时避免药物在肝脏的首过效应,而达到药物经皮渗透吸收的目的[8]。

　　通过对本实验中止咳硬膏组延长小鼠咳嗽潜伏时间，减少2min咳嗽次数说明硬膏组有止咳作用，酚红排泄实验在一定程度上提高小鼠气管段酚红排泄量，说明止咳硬膏有止咳化痰作用。同时分析血清中IL-6在免疫组化中的表达情况说明止咳硬膏在炎症、抑瘤方面优于空白组，在一定程度上说明了其可以减少肿瘤压迫刺激性及阻塞性炎症咳嗽。由于实验时间较短，3组肿瘤生长差异不明显，故小鼠体重、瘤重及抑瘤率无明显差别。止咳硬膏是否有抑瘤作用，有待进一步深入研究。。

　　【参考文献】：

　　[1] 孙燕,石远凯.临床肿瘤内科手册[M].5版.北京:人民卫生出版社, 2008:388.

　　[2] 钟颖.拔罐治疗外感咳嗽31例[J].湖南中医杂志,1995,11(02):48-49.

　　[3] 李桂香.白介素-6对肺癌诊断及预后评价的临床价值[J]. 肿瘤防治研究,2001,28(02):102-103.

　　[4] 陈万灵,欧阳学,余宗阳.中晚期非小细胞肺癌常见中医证型与血清前炎症因子水平相关性研究[J].中华中医药杂志(原中国医药学报),2012,27(06):1718-1720.

　　[5] 胡素连,李悦,潘鹏翔,等.川杏合剂止咳化痰作用的实验研究[J].中国药师,2012,15(12):1701-1703.

　　[6] 柳兴其,陈检芳,肺癌患者治疗前后血清白细胞介素-6、肿瘤坏死因子和血管内皮生长因子水平及其临床意义[J].中国现代医学杂志,2006,16(18):2776-27 78.

　　[7] 姜德友,郭加利.咳嗽病源流考[J].中华中医药学刊,2011,29(03):145-146.

　　[8] 昌晓军,周艳,曾凡芝,等.肝素肺俞穴经皮给药佐治小儿肺炎的临床研究[J].实用临床医学,2003,4(2):101-103.